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Résumé

Au cours des dernières années, un développement considérable de l’analyse de la cellule unique a été observé grâce au séquençage de nouvelle génération (NGS), dans lequel la microfluidique joue un rôle central. Le séquençage de la cellule unique transforme déjà l’étude des systèmes mammifères. Toutefois, jusqu’à présent, cette technologie n’a été que peu utilisée pour étudier les pathogènes.

Des systèmes commerciaux ont été développés par Fluidigm à travers les appareils C1 et Polaris. Malheureusement, ces dispositifs ne sont pas utilisables directement pour les pathogènes ou les cellules infectées, ils sont compliqués à utiliser dans les environnements de biosécurité P2+ et P3, et il n’est pas facile de retracer les cellules individuelles pour l’analyse des données « omics ».

La microfluidique à base de gouttelettes est un système alternatif permettant une analyse à haut débit de la cellule unique, dans laquelle des gouttelettes aqueuses (échelle du nanolitre au femtolitre) disposées dans une huile porteuse fluorée et inerte sont utilisées comme microréacteurs indépendants contenant des cellules uniques. Ici, comme les gouttelettes peuvent être fabriquées et manipulées à des fréquences de l’ordre du kHz, le débit peut facilement atteindre des millions de cellules individuelles par heure. Cette approche a été utilisée pour le criblage phénotypique à haut débit de bactéries, levures, insectes, champignons filamenteux et cellules de mammifères.

Des systèmes microfluidiques à base de gouttelettes sont maintenant disponibles dans le commerce. Ils permettent le séquençage de l’ARNm de la cellule unique (séquençage en 3’ de l’ARNm via la queue poly(A)). Tous utilisent des billes à code à barres et sont capables d’analyser jusqu’à ~104 cellules mammaliennes par expérience. Ces systèmes ne peuvent pas exploiter les informations disponibles à la résolution subcellulaire pour l’interprétation des données de séquençage de l’ARN.

Grâce à la subvention du DIM ELICIT, les chefs d’équipe des deux établissements mettront en place un dispositif à base de gouttelettes qui utilise les informations disponibles à l’échelle microscopique. Ceci permettra la sélection et le tri individuel des pathogènes et des cellules infectées pour l’analyse des données « omics », comme le séquençage de l’ARN de la cellule unique, au niveau de biosécurité approprié.

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En 2017, Illumina et Bio-Rad ont lancé la solution de séquençage monocellulaire Illumina Bio-Rad. Une plate-forme ouverte pour l’analyse de séquences d’ARN de cellules uniques, Drop-seq est également disponible et des instruments microfluidiques pour faire fonctionner ce système sont produits par Elveflow et Dolomite. Cependant, il n’existe actuellement aucun système commercial pour le séquençage de l’ARN d’organismes pathogènes uniques, y compris les bactéries, les virus et les parasites eucaryotes unicellulaires. Les systèmes existants (i) ne sont pas compatibles avec les normes de sécurité pour travailler sur des pathogènes (ils ne sont pas compatibles avec les laboratoires P2+/P3), (ii) ne peuvent pas être utilisés pour séquencer les ARN dépourvus de queues de polyA (ex : ARNm bactériens), (iii) ne permettent pas de faire du séquençage ARN en utilisant des amorces customisées spécifiques à un gène ciblé et avec des codes barres optimisés pour le pathogène, (iv) ne permettent pas la lyse des cellules pathogènes à la membrane coriace pour en libérer l’ARN (ex : les cellules bactériennes), et (v) n’offrent pas la possibilité de réaliser des analyses phénotypiques sur puces ou du tri de cellules via des mesures de fluorescence.

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